초안정성과 가역적으로 광전환이 가능한 형광 단백질의 합리적인 설계

Scientific Reports 6권, 기사 번호: 18459(2016) 이 기사 인용

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광변형 형광 단백질은 여러 나노스코피 접근법의 핵심입니다. 그러나 아직까지는 산화 조건을 유지하는 세포 구획에서 초고해상도 이미징을 허용하는 사용 가능한 변형이 없습니다. 여기에서는 세균 주변세포질에서 접히고 광전환할 수 있는 두 개의 가역적으로 전환 가능한 형광 단백질인 rsFolder 및 rsFolder2의 합리적인 설계를 보고합니다. rsFolder는 Superfolder-GFP와 rsEGFP2의 하이브리드화에 의해 설계되었으며 전자의 빠른 접기 특성과 후자의 빠른 전환 기능을 상속했지만 전환 대비가 감소했습니다. rsFolder 및 rsEGFP2의 스위칭 메커니즘에 대한 구조적 특성 분석을 통해 발색단 시스-트랜스 이성질체화에 대한 다양한 시나리오가 밝혀졌으며 향상된 스위칭 대비를 나타내고 RESOLFT 나노스코피를 사용할 수 있는 rsFolder의 변형인 rsFolder2를 설계할 수 있었습니다. rsFolders는 E. coli 주변세포질에서 효율적으로 발현될 수 있어 지금까지 관찰할 수 없었던 세포 구획에 국한된 단백질에 대한 나노 규모 조사의 문을 열었습니다.

초고해상도 현미경 검사법을 통해 살아있는 세포의 세포 내 세부 사항을 나노 수준으로 시각화하는 것은 종종 "광변형" 형광 단백질(PTFP)을 유전적으로 암호화된 마커로 사용하는 데 의존합니다1. 따라서 향상된 생화학적 또는 광물리학적 특성을 가진 PTFP의 엔지니어링은 다양한 나노스코피 접근법의 개발을 촉진했습니다2,3. 특히, RESOLFT(가역적 포화 광학 형광 전환)4, 비선형 SIM(구조적 조명 현미경)5 또는 pcSOFI(광색성 확률적 광학 변동 이미징)6과 같은 방법은 형광성 형광체 사이를 반복적으로 전환할 수 있는 가역적으로 전환 가능한 형광 단백질(RSFP)을 활용합니다. ('on') 및 비형광('off') 상태. 소위 "네거티브 스위칭" 녹색 RSFP에서 온-오프 전환은 청록색 빛(~490 nm) 조명 시 형광 방출과 경쟁하는 반면, 오프-온 전환은 보라색 빛(~490 nm) 조명에 신속하게 반응합니다. 405nm). 음성 RSFP의 서브패밀리는 처음에는 Dronpa7과 그 변종8,9으로 구성되었으며 rsCherryRev10, rsTagRFP11, mGeos12 및 이광변색성 IrisFP13 및 NijiFP14와 같은 곤충류 기원의 다른 단백질(산호 및 말미잘)이 점진적으로 풍부해졌습니다. 그러나 살아있는 세포에서 RESOLFT 나노스코피를 개발하려면 낮은 조명 전력에서도 효율적으로 전환하고(사진 손상을 최소화하기 위해) 꺼진 상태에서 잔류 형광을 최소화하며(대비를 최대화하기 위해) 전환 피로에 대한 저항력이 높은 RSFP가 필요합니다. 다수의 연속적인 온-오프 스위칭 사이클을 유지합니다. 하이드로조아 기원의 형광 단백질(해파리), 특히 잘 알려진 EGFP로부터 조작된 변이체가 이러한 요구 사항을 충족하여 rsEGFP15 및 rsEGFP216을 생성할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 아주 최근에는 방향성 진화를 통해 얻은 rsEGFP의 변이체가 포유류 세포의 세포질에서 성숙하고 보다 효율적으로 발현되는 것으로 보고되었습니다. Padron8에서 진화된 포지티브 스위처 Kohinoor18과 mEos3.119에서 진화된 네거티브 스위처 Skylan-S를 포함하여 강화된 광전환 특성을 갖춘 anthozoan 기원의 RSFP도 도입되었습니다.

PTFP의 집중적인 개발에도 불구하고 일부 세포 하부 구조는 나노 규모, 특히 퍼옥시솜, 소포체, 미토콘드리아 막간 공간 또는 박테리아 주변세포질과 같이 산화 접힘이 일어나는 구획에서 제대로 탐색되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이러한 구획에는 약물 흡수, 에너지 생산 또는 산화 대사에 관여하는 수많은 주요 거대분자가 들어 있습니다. 초해상도 분야에서 이러한 격차가 발생하는 주된 이유는 형광 단백질이 일반적으로 고도로 산화적인 환경에서 적절하게 접혀 빛을 방출할 수 없기 때문입니다. 따라서 살아있는 세포에서 이러한 구획의 초고해상도 이미징을 촉진하려면 산화적 접힘이 가능한 PTFP의 개발이 필요합니다.