커뮤니케이션 생물학 5권, 기사 번호: 1358(2022) 이 기사 인용
1180 액세스
1 인용
4 알트메트릭
측정항목 세부정보
초상자성 나노비드는 생물검정에서 나노운반체(세포외 소포, 지단백질 및 바이러스)의 면역포획을 위해 마이크로비드에 비해 높은 수율 포획, 배양 시간 감소, 더 높은 포획 능력 등 여러 가지 장점을 제공합니다. 그러나 나노비드는 초상자성 특성이 높은 나노규모 자기장 구배를 요구하기 때문에 "풀다운"이 어렵습니다. 여기에서는 전착된 트랙 에칭 멤브레인이 나노기공 주위에 여러 개의 가장자리를 가진 독특한 초상자성 나노 가장자리 링을 생성하는 것으로 나타났습니다. 균일한 외부 자기장을 사용하면 이 나노 에지 접합의 유도된 단극과 쌍극자가 결합하여 10배 더 높은 나노비드 포획력을 생성합니다. 조밀한 나노비드 현탁액은 99% 비드 포획률로 높은 처리량으로 자성 나노다공성 막(MNM)을 통해 필터링될 수 있습니다. 나노비드/MNM에 의한 이종 매체의 특정 나노캐리어 수율은 80%를 초과합니다. 재현성, 낮은 손실 및 농도 독립적인 캡처 속도도 입증되었습니다. 따라서 이 MNM 재료는 생리학적 샘플에 대한 나노비드 면역포획의 적용을 확장합니다.
세포외 소포(EV)와 지질단백질은 다양한 생물학적 체액1,2,3에서 발견될 수 있는 생물학적 나노입자입니다. 최근 발견된 세포 간 분자 화물 전달 기능은 많은 분야에서 상당한 연구 활동을 촉진했습니다4,5. 이러한 생물학적 나노운반체는 세포 간 의사소통의 중요한 중재자가 될 수 있습니다6,7. 따라서 특정 EV, 지단백질 및 분자 화물도 잠재적인 질병 바이오마커입니다8,9,10. 그러나 이러한 바이오마커는 질병에 걸린 세포에만 고유한 것이 아니라 단순히 과발현되는 경우가 많습니다. 따라서 정확한 정량화가 필요합니다. 크기와 이질성으로 인해 특정 EV와 지단백질의 고수익 분리는 여전히 어려운 일이며 바이오마커 분석에 상당한 편향을 초래할 수 있습니다. EV와 지질단백질은 또한 많은 장치에서 분해, 응집 또는 흡착되는 경향이 있습니다. 따라서 전처리/분리 과정이 길고 복잡하기 때문에 즉각적이고 단기간 접촉하는 분리가 유세포 분석 및 크로마토그래피 분리보다 선호됩니다. 따라서 효과적이고 신속하며 접근 가능한 분리 방법은 EV 및 지질단백질과 관련된 모든 임상 적용을 위한 전제조건입니다. 고수율 포획 기술의 발전은 병원성 바이러스 또는 박테리아의 검출을 포함하여 많은 생물의학 분야에 걸쳐 유익합니다.
가장 구체적인 EV 및 지질단백질 분리 방법은 면역포획입니다. 그러나 면역침전(IP) 및 면역친화성 크로마토그래피와 같은 전통적인 면역포착 기술은 프로브 포화 및 분석물질 손실로 인해 수율이 낮은 문제가 있습니다. 나노운반체가 형광 표지된 경우, 자성 마이크로비드에 의해 포획된 나노운반체는 유세포 분석법으로 분류 및 정량화될 수 있습니다. 그러나 라벨링 및 분리 과정은 시간이 많이 걸리고 최적의 수율을 달성하는 데 하루 이상이 필요할 수 있으므로 상당한 나노캐리어 손실이 발생할 수 있습니다. 수송이 제한된 도킹 반응에 대한 마이크로비드의 이동성이 낮기 때문에 처리량은 긴 배양 시간(8~48시간)으로 인해 제한됩니다. 수율 및 배양 시간 문제에 대한 해결책은 나노자기 비드를 사용하는 것입니다. 부피당 큰 표면적은 더 많은 결합 사이트를 제공합니다. 크기가 작을수록 확산성이 높아지고 배양 시간이 단축됩니다(~30분). 비드는 또한 이질적인 생리학적 샘플을 통해 확산되어 복합체화 또는 응집으로 인해 이동성이 감소된 특정 나노입자 표적을 포착할 수도 있습니다. 부피당 큰 표면적은 동일한 비드 중량 농도에 대한 마이크로비드/나노비드 반경 비율(~100)과 동일한 계수로 더 많은 결합 프로브를 제공합니다. 프로브 수의 이러한 증가는 특히 항체 프로브가 높은 친화성을 갖는 경우 모든 표적 나노캐리어의 완전한 고갈을 초래할 수 있으며, 따라서 수십 배 더 높은 나노캐리어 결합 수율을 제공합니다.
4 ×) trapping is necessary to produce >90% yield. A magnetic film can produce a higher field penetration length than a magnetic bead due to its non-focusing (non-radial) geometry. Recently, Issadore and colleagues developed a magnetic layer-coated nanoporous membrane with improved capture yield, but multiple layers of membranes are still required for efficient bead capture22. Although the field is long-range, the field gradient is not for a planar magnetic film, except at corners. In our earlier work on electric fields at microchannels23 and nanopores24, we showed that a singular electric field with a high gradient occurs in the high-permittivity (water) side of a wedge corner of a channel or a pore if the wedge angle α of the higher permittivity phase exceeds π. This wedge singular field decays radially from the wedge tip with a power-law scaling of −(π/α) − 1 and hence also has a high-field gradient. The radial decay exponent is bound between −2 of a sphere and −3/2 of an infinitely long cylinder. This singular wedge mode is antisymmetric around the wedge and introduces a dipole in the high-permittivity phase. There is a more well-known "lightning rod" wedge singularity in near-field plasmonics25,26,27 that is symmetric around the wedge, with the singular field occurring on the low-permittivity side. It occurs when the high-permittivity side has a wedge angle that is less than π. It introduces a monopole on the low-permittivity side of the wedge. Herein, we extend this concept to magnetic fields to achieve high-yield capture of superparamagnetic beads with high throughput. We designed a multi-edge superparamagnetic NiFe nanoedge with a heterogeneous junction, whose edges sustain both a magnetic monopole and dipole around each nanopore of a nanoporous polymer membrane. This approach will significantly increase the capture yield of one membrane to 99% at a throughput of 5 mL/h for a single magnetic nanoporous membrane (MNM)./p>80% of HDL is recovered using the method, nearly doubling the recovery rate for commercial kits. We also demonstrated that MNM has a high and consistent yield and hence, can provide the necessary statistics for quantifying biomarkers carried by EVs and lipoproteins in heterogeneous physiological fluids (Fig. 1c)./p>99% of the beads were captured. The bead capture efficiency did not diminish even at a flow rate of 5 mL/h. This throughput is high enough for most extracellular vesicle immunocapture applications. Furthermore, only 13% of the beads were lost when the flow rate was increased to 10 mL/h. For membranes with 1-μm pore size, the bead capture efficiency was still >80% at 1 mL/h. In stark contrast, only 22% of beads were captured by the sputtered 450-nm membrane (Fig. 3e). For larger vesicles above 300 nm, electroplated MNM with 1μm pore size can be used at a lower flow rate or with a higher external magnetic field./p>80% of HDL was recovered using this approach. To confirm the specificity of the immunocapture and non-specific adsorption in our device, two negative controls were tested. If no antibodies were functionalized onto the nanobeads in the experiments, <10% of HDL was lost in the device, which was due to non-specific adsorption and experimental error. When antibodies (Abcam, ab139401, rabbit monoclonal to ApoB) against apolipoprotein B, the structural protein for low-density lipoproteins (LDL), were used instead of anti-ApoA-I, the loss increased to 14%. The additional 4% loss may come from the non-specific capture of HDL by anti-ApoB. In both negative controls, the non-specific capture rate of <15% is significantly lower than the specific capture rate of 80%. We benchmarked our method to a commercial immunocapture kit using their standard protocol (see Supplementary Note 5). As shown in Fig. 4c, for nanobeads, only 20% HDL was captured by the μColumn (Milyteni Biotec) because of the low bead capture efficiency of the packed column. Furthermore, for microbeads like Dynabeads™, even after 16 h of incubation, which is much longer than the standard protocol, the HDL capture efficiency does not exceed 50%. For the same incubation time of 1 h as the nanobeads, only 25% HDL was recovered (Supplementary Fig. S4), marginally >15% non-specific capture rate./p>80% of HDL particles recovered and minimal non-specific retention at less than 15%. The high and consistent yield of our system provides quantification potential for studies of EVs, lipoproteins, and other extracellular RNA carriers. We further demonstrated the performance of MNM in exosome capture, purification of HDL-enriched EV samples, and EGFR-positive EVs characterization. The direct lysis protocol in this study is applicable to a variety of downstream analyses for biomarker discovery and diagnostics, such as qRT-PCR, MS-based proteomics, sequencing, etc. For drug delivery, tissue engineering, and other applications requiring intact EVs as carriers, an EV-releasing protocol is necessary. Dissociation buffers36,37, photo-cleavable linker38, and protease-sensitive linkers39 are potential strategies to detach the EVs from the MNM. Our platform is also applicable for other molecular or virus immunocapture applications where capture efficiency and throughput are essential. In addition to the isolation of specific EVs from plasma for liquid biopsy applications (disease screening and therapy management), the MNM technology should also be useful for biomarker discovery from cell cultures, as we have demonstrated here for the DiFi sample, and also for organ-on-the-chip or organoid models35,40,41,42./p>4 buffer changes and concentrated with 3000 Da m.w. cutoff filters (Millipore). Total protein levels were determined for each lipoprotein sample (HDL and LDL) by BCA colorimetric assays (Pierce, ThermoFisher)./p>
한국어 
English
Français
Deutsch
Español
Italiano
Português
日本語
Русский