바이러스 막 융합을 향상시킬 수 있는 소분자 식별

바이러스학 저널 20권, 논문 번호: 99(2023) 이 기사 인용

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고병원성 바이러스의 유입을 분석하기 위해 여러 가지 접근법이 개발되었습니다. 이 연구에서 우리는 현미경 기반 장비 없이 SARS-CoV-2 S 매개 막 융합을 안전하고 효율적으로 모니터링하기 위한 BiMuC(이분자 다세포 보완) 분석의 구현을 보고합니다. BiMuC를 사용하여 우리는 승인된 약물 라이브러리를 스크리닝하고 S 단백질 매개 세포-세포막 융합을 향상시키는 화합물을 확인했습니다. 그 중 에티닐에스트라디올은 체외에서 SARS-CoV-2와 인플루엔자 A 바이러스의 성장을 촉진합니다. 우리의 연구 결과는 SARS-CoV-2를 포함하여 외피 바이러스의 수명 주기를 조절하는 소분자를 식별하는 BiMuC의 잠재력을 보여줍니다.

새로운 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)[1, 2]는 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)로 알려진 유행병을 일으켰습니다. 이 질병은 우리의 의료 시스템과 세계 경제에 엄청난 영향을 미쳤고 앞으로도 계속해서 영향을 미칠 것입니다. 따라서, 코로나19 질병과 관련된 질병률과 사망률을 줄이기 위한 예방 및 치료 방법을 개발하기 위해 특별한 노력이 이루어져 왔습니다.

세포막은 바이러스가 새로운 세포를 감염시킬 때 직면하는 첫 번째 장벽입니다. 진입 중 어느 시점에서 외피 바이러스는 세포막과 바이러스막을 융합해야 합니다. SARS-CoV-2의 경우, 고도로 당화된 스파이크(S) 단백질이 숙주 세포에 진입하는 역할을 합니다[3]. 클래스 I 삼합체 융합 단백질인 S 단백질[4]은 비활성 형태(S0)로 번역됩니다. 숙주 프로테아제(즉, TMPRSS2)에 의한 S0의 단백질 분해 활성화는 비리온에 통합된 성숙한 예비융합 S 단백질을 생성합니다[5]. 감염 과정은 S 단백질이 세포 표면의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)에 결합하는 것으로 시작됩니다[2, 6]. ACE2에 결합하면 구조적 변화가 발생하여 S 단백질 융합 펩타이드가 노출되어 숙주 막과 상호 작용하고 바이러스 막과 세포 막의 융합이 시작됩니다. 이 복잡한 프로세스의 여러 단계를 촉진하면 바이러스 생산 속도가 빨라지고 증가하며 기존 백신 개발이 가속화되고 생산 비용이 절감되며 제조 수율이 높아집니다[7].

유사 유형 바이러스 기반 분석, 바이러스 유사 입자 기반 분석, 생화학적 분석 또는 세포-세포 융합 분석을 포함하여 바이러스 진입을 안전하게 분석하기 위한 다양한 접근법이 개발되었습니다. 바이러스 융합 기구와 세포 표면의 해당 숙주 수용체의 발현으로 인해 Syncytium 식별은 전통적으로 현미경으로 수행되었습니다. 그러나 현미경 기반 방법론은 융합 과정의 정량화와 소분자 식별을 위한 높은 처리량 방법의 구현을 방해합니다.

SARS-CoV-2 S 매개 막 융합 과정을 연구하기 위해 우리는 최근 개발된 BiMuC(이분자 다세포 보완) 분석법을 적용하기로 결정했습니다[8]. 형광 리포터 단백질의 이중 분자 보완 특성을 기반으로 하는 이 분석은 현미경 기반 장비의 도움 없이 바이러스 유발 세포-세포 융합 이벤트의 식별 및 정량화를 용이하게 합니다. SARS-CoV-2 연구를 위해 BiMuC를 수용한 후, 우리는 S 단백질 매개 막 융합 과정을 조절할 수 있는 작은 분자에 대한 스크린을 설정했습니다. 우리는 이 분석법을 사용하여 1280개의 작은 분자를 스크리닝했으며 에티닐에스트라디올이 S 단백질 매개 세포-세포막 융합을 향상시키는 것을 확인했습니다. 결과적으로 에티닐에스트라디올은 체외에서 SARS-CoV-2의 성장을 증가시킵니다. 또한, 바이러스 매개 막 융합에 대한 효과는 SARS-CoV-2에만 국한되지 않습니다. 우리는 에티닐에스트라디올이 인플루엔자 A 바이러스 성장과 니파 바이러스 막 융합을 증가시킬 수 있음을 입증했습니다. 우리의 결과는 BiMuC를 구현하여 SARS-CoV-2 막 융합 과정을 모니터링하고 이 과정을 교란시키는 작은 분자를 식별할 수 있음을 보여줍니다.

1.5. Hits were confirmed in secondary screening. This time cells included the pRL-Renilla. The luminescence was measured using the Renilla Luciferase Assay kit from Sigma following the manufacturer protocol on 96-well white cell-culture plates. This measure facilitates the elimination of those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. To discard the hits that had fluorescent properties similar to VFP, cells were seeded in black 96-well plates and treated with the compounds under the same conditions as described above. In this case, fluorescence was measured as before (λexc = 485 nm, λem = 535 nm). In all assays, [DMSO] was kept at ≤ 1%. Statistical analysis was done with Libre Office Calc./p> 1.5 (Table S1). Hits were re-tested using the same experimental conditions and selection criteria. Only the compounds capable of enhancing viral fusion in both rounds were considered (Fig. 2B). Additionally, we measured the luminescence from the Renilla luciferase and eliminated those compounds promoting cell division or survival, thus increasing the fluorescence signal without effectively increasing cell-cell fusion. We also tested the fluorescence properties of the remaining hits and discarded those compounds emitting near 530 nm (Fig. 2B)./p>